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检测方法的介绍!!!!!!!!

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发表于 2006-11-14 06:47:00 | 显示全部楼层 |阅读模式
1.免疫学方法

  HIV抗体一般在人感染后几周逐渐出现,可延续至终生,血清学试验分为初筛和确认试验。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验(WB)。

表2 常用的HIV实验室检测方法

免疫学方法

HIV抗体检测

常规实验方法:

酶联免疫吸附试验(ELISA)

免疫印迹试验(WestBlot)

间接免疫荧光法(IFA) 

快速检测方法:

明胶颗粒凝集试验 

斑点免疫结合试验 

HIV抗原检测 

P24抗原的检测

分子生物学方法

RT-PCR检测法

荧光实时PCR检测技术

支链DNA(bDNA)

连接酶酶促链式反应(LCR)

核酸序列依赖性扩增(NASBA)

转录介导的扩增(TMA)

细胞培养与检测

淋巴细胞培养

  1.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)
    ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物,酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、分光光度计观察结果。初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。
    第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。
    第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板,由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高。
    第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。
    第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。

表3 四代ELISA检测试剂的比较

代数固相包被物偶联物检测特异性

第一代HIV-1全病毒裂解物抗人IgG的二抗抗HIV-1 IgG

第二代HIV-1/-2人工重组抗人IgG的二抗抗HIV-1/2 IgG

或化学合成多肽抗原

第三代HIV--1/-2/-0人工重组或HIV--1/-2/-0人工重组或抗HIV-1/-2/-0

化学合成多肽抗原化学合成多肽HIV抗原IgG/IgM

第四代HIV--1/-2/-0人工重组或HIV--1/-2/-0人工重组或抗HIV-1/-2/-0

化学合成多肽抗原化学合成多肽HIV抗原IgG/IgM

及抗P24抗原抗体及抗P24抗原抗体及P24抗原

图2 四代试剂的反应示意图

  窗口期是HIV检测过程中涉及到的一个重要概念,HIV的窗口期是指虽有HIV感染,但实验室检测为阴性的一段时间,它的长短直接取决于检测试剂的质量。关于窗口期排查时间,目前医学界存在很多争论,有说6~8周的,也有说3个月的,最保守的说法是6个月,国内比较认同的说法是3个月,超过3个月检测结果仍为阴性者,可以排除HIV感染的可能性。由于病毒检测的窗口期问题的存在,输血导致HIV/AIDS的传播仍是不可避免的。但随着检验方式的进步和检验试剂的改进,窗口期已经大大缩短,极大地降低了输血传播HIV/AIDS的可能性(图3)。


  图3 不同检测方法和不同检测试剂检测的窗口期

   从图3中可以看出每一代试剂的改进都会缩短窗口期,其中与第三代试剂相比,第四代试剂检测窗口期平均缩短了4~5天。

  1.2 免疫印迹试验(WB)
  免疫印迹试验主要用于确认试验,基本原理是HIV全病毒抗原经过SDS-PAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后,即可使有反应的抗原-抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果。有报告说免疫印迹试验的特异性不是很好, 有大约2%的假阳性率,但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验。

  1.3 免疫荧光试验(IFA)
  基本原理为应用H-9或HUT-78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞,该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上,固定,制备为抗原片,加入待检血清,待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。

  1.4 明胶颗粒凝集试验(PA)
  PA的基本过程是先将样品稀释,然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒,混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时,经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便,无需特殊仪器设备,适合对少量标本的检测。

  1.5 斑点印迹试验(或免疫层析/或渗滤)
  斑点印迹试验一般采用硝酸纤维素膜作固相载体, 用HIV抗原包被于固相载体,加入待测标本(可为血清,血浆,尿液和其它体液),一定温度反应后洗去未结合于固相载体上的标本,包被抗原和被检血清中抗体结合,用胶体金(或胶体硒)代替底物连接在葡萄球菌蛋白A上,金标记蛋白A具有与人Ig结合的能力,因而可与被捕获的HIV抗体结合。若样品中有HIV抗体,则薄膜上就会产生一桔红色斑点(或线条),一般3~10 min出结果,特异性较好, 较为适宜于偏远地区临床用血检测,但不适于城市地区的献血员筛查。

  1.6 HIV抗原检测
  HIV抗原通常检测的是 P24抗原,采用的方法通常为夹心法ELISA, 具体过程大致为:将纯化的已知抗体包被在固相反应板孔底,当加入待测血清后,若血清中含有P24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物,再加入酶(HRP)标记的HIV抗体,在抗原上又结合了酶标记的抗体,加底物显色后,在酶标仪上读结果,其敏感度约为50~100pg/ml标本浓度。

  2.分子生物学方法

  随着生物技术的发展,核酸检测得到了人们越来越多的重视,它可直接检查HIV RNA,可在发现血清学变化之前检测HIV感染,而且比P24抗原检测方法更灵敏。

  2.1 多聚酶链反应(PCR)检测法
  PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
  ① 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
  ② 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
  ③ 引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIV-RNA,需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA,继而以cDNA为模板进行PCR扩增即可,这样的反应称为RT-PCR。

图4 RT-PCR示意图

  2.2 实时荧光定量PCR技术
  实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

图5 实时荧光定量PCR技术示意图

  本技术的原理(图5)是使用荧光基团标记探针,5′端标记荧光基团R,3′端标记淬灭基团Q,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间,利用Taq酶的5′-3′外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到,一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。

  2.3 支链DNA检测法—bDNA
  bDNA是定量检测血浆中的HIV-1型RNA的一种方法。bDNA是指人工合成的带有侧链的DNA片段,在其每个侧链上都可以标记被激发的标记物。将HIV的RNA通过离心从病毒颗粒中释放出来,然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合,又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。在微孔中形成了HIVRNA-寡核苷酸复合物。再加入一种化学发光底物孵育后可放大化学发光信号。通过发光强度来定量,因为发光强度与样品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在扩增物的交叉污染,这较PCR是一大进步。bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针,可以方便地检测HIV某些变异株,但灵敏度不及PCR,提高bDNA灵敏度是一大难点。

  2.4 核酸序列依赖性扩增法-NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)
  NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在 42℃进行 ,可在 2h内将RNA模板扩增约 109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增 [16]。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNANA杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火, 在反转录酶作用下合成第二条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA,RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA,进入循环相,对模板进行大量扩增(图6)。

  图6 NASBA法示意图
(Reesink HW.HepatitisCVirus.KARGER,1998:79)

  2.5 转录介导的扩增技术—TMA(Transcription mediated amplification)
  TMA技术原理与NASBA基本一致(图6,7),略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶,MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在 41.5℃进行 ,可在 1h内将RNA模板扩增约 109倍。

TMA技术示意图

  2.6 连接酶酶促链式反应(LCR)
  LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术,是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交,当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。

     


           图7 连接酶酶促链式反应图                         

  以上介绍的几种核酸检测方法各有其特点(见表4)

表4几种核酸检测方法的比较

方法

靶分子扩增

信号扩增

温度循环

敏感性

PCR

LCR

NASBA

B-DNA

对数扩增

不扩增

对数扩增

不扩增

不扩增

对数扩增

不扩增

线性扩增

  3.细胞培养与检测

  常规方法是将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养, 经适当周期培养后测定培养液HIVp24抗原, 进而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。细胞培养方法与血清学方法相比,专一性很强,不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或PCR, 因为必须有一定数量的感染细胞存在才能培养出病毒来。

  以上简述了HIV的流行概况和实验室的检测技术,相信随着HIV实验室检测技术的不断的改进,尤其是核酸检测技术的不断应用,HIV检测的窗口期将会逐步缩短,经输血传播HIV可能性也将会大大减小。

发表于 2006-11-14 11:24:00 | 显示全部楼层
欢迎加入版主行列。[em44][em44][em44][em44][em44]
发表于 2006-11-22 14:12:00 | 显示全部楼层

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发表于 2006-11-28 13:10:00 | 显示全部楼层
是一好贴。大家都看一下,多掌握一些知识没坏处。
发表于 2007-1-26 13:49:00 | 显示全部楼层

好贴

发表于 2007-5-26 09:58:00 | 显示全部楼层
长知识了我
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